Un circuito desde las neuronas neurotensinas del tabique lateral hasta el núcleo tuberal controla la alimentación hedónica

Molecular Psychiatry volumen 27, páginas 4843–4860 (2022)Cite este artículo

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El comportamiento alimentario está regulado tanto por las necesidades homeostáticas del cuerpo como por los valores hedónicos de los alimentos. El fácil acceso a alimentos sabrosos y ricos en energía y la consiguiente epidemia de obesidad subrayan la necesidad urgente de una mejor comprensión de los circuitos neuronales que regulan la alimentación hedónica. Aquí, informamos que las neuronas positivas para neurotensina en el tabique lateral (LSNts) desempeñan un papel crucial en la regulación de la alimentación hedónica. Silenciar los LSNts promueve específicamente la alimentación con alimentos sabrosos, mientras que la activación de los LSNts suprime la alimentación general. Las neuronas LSNts se proyectan al núcleo tuberal (TU) a través de la señalización GABA para regular la alimentación hedónica, mientras que la señal de neurotensina de LSNts → el núcleo supramamilar (SUM) es suficiente para suprimir la alimentación general. Las imágenes de calcio in vivo y la manipulación optogenética revelan dos poblaciones de neuronas LSNts que se activan e inhiben durante la alimentación, lo que contribuye a la búsqueda y el consumo de alimentos, respectivamente. La activación crónica de LSNts o LSNts→TU es suficiente para reducir la obesidad inducida por una dieta alta en grasas. Nuestros hallazgos sugieren que LSNts→TU es una vía clave en la regulación de la alimentación hedónica.

La incidencia de la obesidad y las enfermedades metabólicas relacionadas ha aumentado rápidamente en las últimas décadas y se ha convertido en un importante problema de salud en todo el mundo [1]. Un factor importante que subyace a la pandemia de obesidad es comer en exceso debido a la abrumadora disponibilidad de alimentos muy sabrosos y ricos en calorías en la sociedad moderna. La alimentación puede ser impulsada por las demandas de energía, que es un mecanismo conservado evolutivamente para mantener la homeostasis metabólica. Esta alimentación homeostática está estrictamente controlada por la actividad de las redes cerebrales y las hormonas circulantes [2,3,4]. Por otro lado, la alimentación hedónica está impulsada por el placer de consumir alimentos sabrosos sin necesidad metabólica, lo que es un factor importante que contribuye a la sobrealimentación y la obesidad [5].

Aunque los circuitos neuronales que median la alimentación homeostática se han estudiado ampliamente, se sabe mucho menos sobre los sustratos neuronales que regulan la alimentación hedónica [6,7,8]. La alimentación homeostática y hedónica podría procesarse mediante circuitos neuronales separados y distintos [6]. Los núcleos hipotalámicos, incluido el núcleo arqueado (ARC) y el área hipotalámica lateral (LHA), son bien reconocidos en la mediación de la alimentación homeostática que transforma las señales de hambre en la búsqueda y el consumo de alimentos [9]. Generalmente, se presume que la alimentación hedónica está mediada por el sistema de recompensa dopaminérgico mesolímbico, incluido el área tegmental ventral (VTA) y su objetivo, el núcleo accumbens (NAc) [2, 10, 11]. Sin embargo, los ratones genéticamente modificados con deficiencia de dopamina dejan de alimentarse y mueren unas pocas semanas después del nacimiento [12], lo que sugiere que el sistema de dopamina VTA también desempeña un papel crucial en la regulación de comportamientos que son importantes para la supervivencia de los animales, como la alimentación homeostática. Además, las neuronas que expresan el péptido relacionado con el agutí (AGRP) en el ARC están bien caracterizadas en el control de la alimentación homeostática [13]. La ablación de las neuronas AGRP suprime el consumo de alimentos habituales, pero no tuvo ningún efecto sobre la ingesta de alimentos sabrosos inducida por la grelina [14]. Según un estudio reciente, la activación de la entrada del tálamo paraventricular anterior (aPVT) a la NAc promueve la alimentación hedónica de alimentos ricos en grasas, pero no tiene ningún efecto sobre la ingesta de comida nocturna [15]. Estos estudios sugirieron que distintos circuitos neuronales podrían contribuir de manera diferente a la alimentación homeostática y hedónica.

El tabique lateral (LS) recibe información del hipocampo y envía proyecciones masivas al hipotálamo; por lo tanto, está particularmente bien situado para integrar información contextual, como la palatabilidad de los alimentos, para guiar el comportamiento alimentario. Estudios anteriores sugirieron funciones potenciales para el LS en la regulación tanto de la alimentación general como de la ansiedad inducida por el estrés [4, 16]. Sin embargo, se sabe poco sobre cómo los tipos y circuitos de células LS contribuyen a la alimentación hedónica.

Examinamos la participación de LS en la regulación de la alimentación hedónica examinando la activación cerebral durante el consumo de alimentos sabrosos sin déficit de energía y luego comparamos la activación de LS durante el consumo de comida regular versus alimentos sabrosos. Utilizando este enfoque, identificamos un subconjunto de neuronas GABAérgicas que expresan neurotensina en el tabique lateral (LSNts) que se activaba específicamente durante la alimentación hedónica. Silenciar los LSNts con inactivación sináptica mediada por neurotoxina tetánica o enfoques optogenéticos promueve específicamente la alimentación con alimentos sabrosos. Sin embargo, la activación de LSNts suprime la alimentación general. Tanto el neurotransmisor canónico GABA como el neuropéptido neurotensina contribuyen a los efectos moduladores de las neuronas LSNts sobre la alimentación. Los LSNts se proyectan al núcleo tuberal (TU) a través de GABA para regular la alimentación hedónica, mientras que la señal de neurotensina en los LSNts → el núcleo supramamilar (SUM) es suficiente para suprimir la alimentación general. La identificación de circuitos y tipos moleculares precisos puede ayudar a desarrollar nuevas terapias dirigidas a la alimentación hedónica para el tratamiento de la obesidad y las enfermedades metabólicas relacionadas.

Todos los procedimientos experimentales y de cría en este estudio fueron aprobados por los Comités de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen (SIAT) de la Academia de Ciencias de China (CAS). Macho adulto (de 3 a 5 meses de edad) C57BL/6 J (Centro de animales de laboratorio médico de Guangdong, Guangzhou, China), Nts-ires-Cre (Jax No. 017525), Rosa26-LSL-Cas9 (Jax No. 024857) En este estudio se utilizaron ratones. Los ratones se alojaron a 22-25 °C en un ciclo circadiano de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

Compramos AAV2/9-hSyn-mCherry-P2A-TetTox-WPRE-pA, AAV2/9-hEF1a-DIO--hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA, AAV2/9-hSyn-DIO-hChR2(H134R) -mCherry-WPRE-pA, AAV2/9-hEF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP, AAV2/9-hSyn-FLEX-GCamP6s-WPRE-pA, AAV2/2Retro-hSyn-DIO-GCaMP6s-WPRE-pA, AAV2 /9-hEF1a-DIO-EYFP-WPRE-pA, AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA, AAV2/9-hSyn-FLEX-tdTomato-T2A--sinaptofisina-EGFP-WPRE-pA, scAAV2/ 2Retro-hsyn-FLEX-Flpo-pA, AAV2/9-hEF1a--fDIO-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA de Tailtool. AAV-U6-sgRNA(LacZ)-pCbh-DIO--hM3D(Gq)-mCherry, AAV-U6-sgRNA(vGAT)-pCbh-DIO-hM3D(Gq)-mCherry y AAV--U6-sgRNA(Nts) -CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherry fueron fabricados por BrainCase utilizando construcciones proporcionadas por Y. Dan en la Universidad de California Berkeley. El N-óxido de clozapina (BML-NS105-0025) se adquirió de Enzo. El CTB-488 (C34775), CTB-555 (C34776) y CTB-647 (C34778) se adquirieron de Thermo Fisher. El anticuerpo c-fos (2250) se adquirió de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos GFP (ab13970) y mCherry (ab167453, ab205402) se adquirieron de Abcam. Las sondas de ARN y los kits de reactivos de hibridación in situ RNAScope se adquirieron en ACDbio.

Los ratones fueron anestesiados con inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg/kg). Se realizó una cirugía estándar para exponer la superficie del cerebro por encima de LS, POA, AHN, TU o SUM. Las coordenadas utilizadas para la inyección de LS fueron: bregma +0,75 mm, lateral ±0,35 mm y dura −2,85 mm. Las coordenadas utilizadas para la inyección de POA fueron: bregma +0,62 mm, lateral ±0,25 mm y dura −4,25 mm. Las coordenadas utilizadas para la inyección de AHN fueron: bregma −0,80 mm, lateral ±0,40 mm y dura −5,0 mm. Las coordenadas utilizadas para la inyección de TU fueron: bregma −1,94 mm, lateral ±1,20 mm y dura −5,10 mm. Las coordenadas utilizadas para la inyección de SUM fueron: bregma −3,0 mm, lateral ±0,25 mm y dura −4,4 mm. Los vectores AAV y CTB-488/594/633 se inyectaron estereotáxicamente con una pipeta de vidrio conectada a un inyector Nano-liter (Drummond Scientific Company) a un caudal lento de 60 nl/min para evitar posibles daños al tejido cerebral local. La pipeta se retiró al menos 10 minutos después de la inyección viral.

Para experimentos de inactivación sináptica y activación quimiogenética, todas las inyecciones (AAV-DIO-EGFP-2A-TeNT, AAV-DIO-EYFP, AAV-DIO-hM3D-mCherry, AAV-DIO-mCherry, AAV-Retro-Flex-FlpO, AAV -fDIO-hM3D-mCherry, AAV-sgRNA(LacZ/vGAT/Nts)-DIO-hM3D-mCherry) fueron bilaterales. Las pruebas de comportamiento se realizaron 3 semanas después de la inyección viral. Para los experimentos de rastreo de vías, las inyecciones de AAV (AAV-DIO-tdTomato-T2A-Synaptophysin-EGFP) y CTB fueron unilaterales en el mismo lado. Los análisis histológicos se realizaron 1 semana (para CTB) o 3 semanas (para AAV) después de la inyección. Para experimentos de manipulación optogenética, fotometría de fibra e imágenes de calcio, se utilizaron inyecciones de AAV (AAV-DIO-ChR2-mCherry, AAV-DIO-mCherry, AAV-DIO-eNpHR-EYFP, AAV-DIO-EYFP, AAV-DIO-GCaMP6m). unilateral y seguido de la implantación de una fibra óptica o un microscopio en miniatura, como se describe a continuación.

Treinta minutos después de las inyecciones de AAV, se implantó una férula de cerámica con una fibra óptica (200 µm de diámetro, NA 0,37) con la punta de la fibra en la parte superior del LS (bregma +0,75 mm, lateral +0,35 mm y dura -2,70 mm). , TU (bregma −1,94 mm, lateral +1,20 mm y dura −4,80 mm) o SUM (bregma −3,0 mm, lateral ±0,25 mm y dura −4,1 mm). Luego se aseguró la férula al cráneo con resinas fotopolimerizables. Después de la implantación, se suturó la piel y se aplicaron antibióticos a la herida quirúrgica. Los experimentos optogenéticos y de fotometría de fibra se realizaron al menos 3 semanas después de la implantación de la fibra óptica.

El procedimiento de cirugía de microscopía en miniatura fue como se describió anteriormente (Resendez et al., 2016). Tres semanas después de la inyección de AAV-DIO-GCaMP6 AAV, se implantó la lente GRIN (Go!Foton, n.º de catálogo CLHS050GFT009) con la punta de la lente en la parte superior del LS (bregma +0,75 mm, lateral +0,35 mm y dura -2,70 mm). . Luego se fijó la lente en el cráneo con resinas fotopolimerizables. La placa base se colocó 3 semanas después de la implantación de la lente GRIN. Los experimentos de comportamiento se iniciaron al menos una semana después de la recuperación de la fijación de la placa base.

Después de la inyección del virus o la implantación de fibras, los ratones se alojaron en grupos (de 3 a 5 animales por jaula) durante al menos 3 semanas antes de las pruebas de comportamiento. Los experimentadores los manipularon diariamente durante al menos 3 días antes de las pruebas de comportamiento. Todos los comportamientos fueron puntuados por los experimentadores, que desconocían el tratamiento de los animales. Todos los experimentos de comportamiento se repitieron al menos 3 veces en el laboratorio.

Los ratones se alojaron individualmente al menos 3 días antes de los ensayos de ingesta de alimentos sólidos. Durante los experimentos de comportamiento alimentario, los diferentes tipos de alimentos (comida estándar, alimentos ricos en sacarosa o alimentos ricos en grasas, ~20 g) se reemplazaron diariamente y las jaulas se cambiaron diariamente para evitar que se acumularan restos de comida en el fondo. La ingesta de alimento se calculó manualmente en la jaula de la casa durante la fase temprana de oscuridad (8:00 a 10:00 p. m.) retirando brevemente la comida de las jaulas y midiendo su peso. Y el aporte calórico se calculó según hoja de carga. Para evitar posibles efectos del estrés causado por el cambio de dieta, los ratones se habituaron a la nueva dieta durante al menos 3 días.

Para el experimento de mapeo de c-fos, el experimento de alimentación se realizó con o sin déficit de energía. Para el grupo de alimentación de control, los ratones fueron alimentados con la comida estándar de laboratorio ad libitum. Para el grupo de alimentación hedónica, los ratones tuvieron acceso ilimitado a la comida estándar, mientras que se les proporcionó comida rica en sacarosa durante 2 h cada día durante 7 días continuos. Se controló la ingesta de alimentos durante este período de 2 horas. Para la alimentación inducida por un déficit energético agudo, se retiró la comida durante 22 horas (grupo en ayunas) y luego se les proporcionó comida estándar (grupo en ayunas + comida) o comida rica en sacarosa (grupo en ayunas + HSF). El experimento se repitió 3 veces en el laboratorio.

Para los experimentos de inactivación sináptica inducida por TeNT y de eliminación mediada por CRISPR/Cas9, las ingestas de diferentes tipos de alimentos se midieron sucesivamente en estado de saciedad o en ayunas, como se describió anteriormente.

Para los experimentos de activación quimiogenética, la ingesta de alimentos se midió 30 minutos después de las inyecciones intraperitoneales de solución salina (0,9%; 200 μl) o CNO (n.º de catálogo BML-NS105-0025, Enzo, 2 mg/kg de peso corporal en solución salina). Las ingestas de diferentes tipos de alimentos se midieron sucesivamente en estado de saciedad o en ayunas.

Para los ensayos de ingesta de alimentos líquidos libres, los ratones fueron enjaulados individualmente con comida y agua ad libitum antes del experimento. Durante el experimento, los ratones se colocaron en la cámara de acondicionamiento operante (22 cm x 16 cm x 15 cm, AniLab). Se administró una gota (10 μl) de líquido (agua, solución de sacarosa al 10%, Garantiza o solución de almidón) cada 10 s, y la secuencia se repitió 180 veces. El líquido era expulsado mediante una bomba que contenía la jeringa que contenía el líquido. Los lamidos fueron monitoreados por un lickómetro hecho a medida con un sensor táctil capacitivo (Sparkfun MPR121) y un microcontrolador (Arduino). Desde el día 1 al día 3, se entrenó a los ratones para que lamieran el pico. Para los experimentos de inactivación sináptica inducida por TeNT, después de 3 días de entrenamiento, el consumo de los diferentes líquidos se midió el día 4. Para los experimentos de activación quimiogenética, los ratones se dividieron en dos grupos al azar el día 4 y se trataron con solución salina o CNO (2 mg /kg de peso corporal en solución salina, IP) 30 min antes de la prueba. Al día siguiente (día 5), ​​los ratones fueron tratados con CNO o solución salina a la inversa y se analizaron nuevamente. Para los experimentos de inhibición optogenética, se utilizó un sistema láser de estado sólido bombeado por diodos de 593 nm para generar el láser azul de 593 nm para la estimulación luminosa. Se utilizó un adaptador FC/PC para conectar la salida del láser a la férula implantada para la administración de luz intracraneal. El día 4, se colocó a los ratones en la cámara de comportamiento y se midió el consumo de alimento líquido mientras la luz estaba apagada. El día 5, los ratones se colocaron en la misma cámara para el ensayo de ingesta de alimentos mientras se administraba estimulación con luz amarilla (593 nm) constantemente durante toda la sesión de alimentación.

Para la alimentación de líquidos condicionada por señales (Assure, alimentos líquidos regulares, agua), se presentó una señal auditiva de 1 s (20 kHz) cada 20 a 24 s después del inicio de la prueba. Inmediatamente después de la presentación de la señal, una bomba que sostenía la jeringa que contenía el líquido expulsó una gota (10 μl) de alimento líquido. Los lamidos fueron monitoreados por un lickómetro hecho a medida con un sensor táctil capacitivo (Sparkfun MPR121) y un microcontrolador (Arduino).

Para la alimentación libre de alimentos líquidos a su propio ritmo, los ratones tuvieron libre acceso a Garantizar a través del pico del lickómetro durante 30 minutos en cada sesión de alimentación a su propio ritmo. Se administró una gota (10 μl) de Garantizar una vez que se detectó una lamida. Cada sesión de consumo a su propio ritmo generalmente contenía múltiples episodios de consumo. Cada episodio se definió como lamido continuo con un intervalo entre lamidos de menos de 6 s. La dinámica neuronal se alineó con la primera lamida de cada combate para su posterior análisis.

Para la manipulación optogenética durante los diferentes experimentos de la fase de alimentación en las figuras 5D-F, la luz azul (473 nm) se entregó a 20 Hz (20 ms de duración del pulso) durante la fase de aproximación o consumo, mientras que se aplicó la luz amarilla (593 nm). constantemente durante la fase de aproximación o consumo.

El día de la prueba de comportamiento, los ratones fueron trasladados a la sala de pruebas y se habituaron a las condiciones de la habitación durante 3 horas antes de que comenzaran los experimentos. El aparato se limpió con etanol al 20% para eliminar el olor de otros ratones. Los ratones se colocaron en una cámara de plástico de campo abierto (40 x 40 cm). Las ubicaciones de los ratones se monitorearon utilizando el software de seguimiento MATLAB personalizado a una frecuencia de muestreo de 30 Hz. La cámara se dividió conceptualmente en un campo central (25 × 25 cm) y un campo periférico para análisis. Se analizó la locomoción total y el ratio de tiempo de permanencia en el centro.

Para los experimentos de activación quimiogenética aguda, los ratones se dividieron en dos grupos al azar y se trataron con solución salina o CNO (2 mg/kg de peso corporal en solución salina, IP) 30 minutos antes de la prueba. A los ratones se les permitió explorar libremente durante 10 minutos. Al día siguiente, los ratones fueron tratados con CNO o solución salina a la inversa y se les volvió a analizar. Para los experimentos de activación quimiogenética crónica, los ratones no fueron tratados con CNO antes de la prueba.

Para los experimentos de inhibición optogenética, se colocaron ratones en la cámara y se les administró estimulación con luz amarilla (593 nm, luz continua con 5 minutos encendidos y 5 minutos apagados intercalados) durante 20 minutos.

Después de la inyección del virus, los ratones se alojaron en grupos (de 3 a 5 animales por jaula) y se alimentaron con la comida estándar. Después de 3 semanas, se midió el peso corporal diariamente. Para los experimentos de inactivación sináptica inducida por TeNT, los ratones fueron alimentados con comida estándar o se les cambió a alimentos ricos en grasas. Para los experimentos de activación quimiogenética, los diferentes grupos fueron alimentados con comida estándar o cambiados a alimentos ricos en grasas. Se inyectó CNO (1 mg/kg en solución salina, IP) dos veces al día.

El gasto de energía se midió utilizando un sistema de calorimetría indirecta (Oxymax, Columbus Instruments) instalado bajo una temperatura ambiental constante (22–25 °C) y un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Los ratones en cada cámara tenían libre acceso a comida y agua.

Para medir la glucosa en sangre, se cortó la cola del ratón horizontalmente en el extremo con una hoja de afeitar y se recogió una pequeña gota de sangre. Luego se midieron los niveles de glucosa usando un medidor de glucosa en sangre (Bayer). Para los experimentos de activación quimiogenética, los niveles basales de glucosa en sangre se midieron primero al inicio de la fase oscura del fotoperíodo. Después de las inyecciones de CNO (2 mg/kg de peso corporal en solución salina, IP), se midieron los niveles de glucosa en sangre 30 minutos después. No se suministró alimento durante el período de medición de glucosa en sangre. Para los experimentos de inactivación sináptica inducida por TeNT, se midió la glucosa en sangre en ayunas después de un ayuno nocturno (16 h). Luego, estos ratones en ayunas recibieron una dosis oral (1,5 g/kg) de solución de D-glucosa al 30 % (n.º de catálogo G6125, Sigma-Aldrich) mediante alimentación forzada. La sangre se recogió al inicio y 10, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la administración de glucosa.

Para la medición de la presión arterial y la frecuencia cardíaca, se empleó el BP-2000 Blood Pressure Analysis System™ (sistema Visitech) y se siguió la guía del usuario. El BP-2000 utiliza fotopletismografía de transmisión, en la que se analizan las variaciones en la cantidad de luz transmitida a través de la cola para determinar la presión arterial y la frecuencia del pulso. Los animales se acostumbraron primero a la medición de la presión arterial durante 3 días antes de comenzar el experimento formal. Las mediciones se realizaron entre las 2 y las 4 de la tarde de cada día. Los ratones fueron trasladados a una sala de medición tranquila una o dos horas antes de realizar las mediciones. Los ratones fueron manipulados con cuidado para mantenerlos lo más tranquilos posible. Coloque el animal dentro de un soporte, con el brazalete alrededor de su cola, y coloque la cola en la parte inferior de la ranura en forma de V en el sensor. Para permitir que los animales se calentaran lo suficiente como para producir un buen flujo sanguíneo en la cola y permitirles acostumbrarse a estar en los portamuestras, se realizó un mínimo de 5 mediciones preliminares antes de comenzar las mediciones reales en cada sesión. En cada sesión se realizaron de diez a veinte mediciones reales.

Para los experimentos de activación quimiogenética, se midieron la presión arterial basal y la frecuencia cardíaca después de 3 días de habituación. Al mismo tiempo, al día siguiente, se midieron nuevamente la presión arterial y la frecuencia cardíaca después de inyecciones de CNO (2 mg/kg de peso corporal en solución salina, IP).

Para medir la temperatura rectal se utilizó un termómetro (TH-5 Thermalert, Physitemp). En primer lugar, pon vaselina en el extremo de la sonda del termómetro. Durante la adquisición de la temperatura rectal, la base de la cola del ratón se fijó con dos dedos y luego se levantó suavemente mientras el animal agarraba una varilla de metal en la tapa de la jaula con sus patas delanteras, permitiendo así la exposición del área anogenital. Los excrementos y la orina se limpiaron para minimizar los efectos de confusión al orinar o defecar. Luego se insertó la sonda con vaselina en el canal anal durante 1,5 centímetros y se leyó la temperatura cuando se estabiliza. La temperatura rectal se midió al menos durante tres días consecutivos antes de que se recogieran los datos formales. Para experimentos quimiogenéticos, la temperatura rectal se midió 30 minutos después de la inyección de CNO (Enzo, número de catálogo BML-NS105-0025, 2 mg/kg de peso corporal en solución salina, IP).

Los experimentos de fotometría de fibra se realizaron al menos 3 semanas después de la inyección de AAV-GCaMP6s. La fibra implantada se conectó al medidor de fibra óptica (ThinkerTech, Nanjing, China) a través de un cable de conexión de fibra óptica (200 μm, 0,37 NA, Inper, Hangzhou, China). Para registrar señales de fluorescencia, se reflejó un haz de un LED 480 con un espejo dicroico, enfocado con una lente acoplada a un detector CMOS (Thorlabs, Inc. DCC3240M). La potencia del LED en la punta del cable de conexión era inferior a 50 μW.

La actividad del calcio neuronal de LSNt se registró en ratones infectados con GCaMP6 durante la alimentación condicionada por señales o a su propio ritmo. Las señales de lamido se recogieron a través de un medidor de lamido casero y se adquirieron mediante un medidor de fibra óptica. El análisis de la señal se realizó con códigos MATLAB escritos a medida. El cambio de fluorescencia (ΔF/F) se calculó como (F-F0)/F0, donde F0 es la señal de fluorescencia inicial (-6 a -4 s antes del primer lamido o inicio de la señal). El área bajo la curva (AUC) se calculó como la media ΔF/F del evento, que fue de -6 a 0 s para la fase de aproximación a los alimentos y de 0 a 8 s para la fase de consumo de alimentos.

Para registrar Ca2+ de LSNts→TU o LSNts→SUM, se inyectaron AAV-Retro-DIO-GCaMP6 en TU o SUM y se implantó fibra óptica en LS en ratones Nts-ires-Cre. Para eliminar los efectos de la deriva de la línea base, el rastro de fluorescencia sin procesar se corrigió como lo describen Xiao et al. (Xiao et al., 2020). Después de la corrección de la deriva de la línea base, las señales de fluorescencia recibieron una puntuación z en relación con la media y la desviación estándar de las señales en una ventana de tiempo de -6 a -4 s antes del inicio de la primera lamida.

Se habituaron ratones con placa base y un microscopio en miniatura adjunto (UCLA miniscope V4, Open Ephys) a la cámara de comportamiento de imágenes (35 cm × 30 cm) durante al menos tres días antes de las sesiones de imágenes. Los datos de imágenes se adquirieron a una velocidad de fotogramas de 30 Hz y con una potencia del LED del 15 % al 35 %. Los datos de imágenes de calcio fueron recopilados por UCLA Miniscope-DAQ-DT-Software. La sincronización entre el microscopio en miniatura y los eventos relacionados con el comportamiento (eventos de lamer y bombear) se logró mediante una placa Arduino personalizada.

El análisis de series temporales de imágenes de calcio se realizó en Python y MATLAB. Los datos de imágenes se muestrearon espacialmente (el doble en xy) y temporalmente (cuádruple). Se utilizó la factorización de matriz no negativa restringida (CNMF-E) para microendoscopia para extraer las respuestas de fluorescencia de GCaMP asociadas con neuronas individuales a partir de los datos procesados ​​(Zhou et al., 2018). Brevemente, estimamos la respuesta de las neuronas individuales mediante CNMF-E y eliminamos manualmente los objetos no neuronales obvios que generalmente tenían tamaños de soma irrealmente pequeños (1 a 5 píxeles) o grandes (más de 100 píxeles).

En las imágenes de calcio convencionales, las señales de fluorescencia se comparan como ΔF/F. Utilizamos la producción bruta inspeccionada de CNME-F como ΔF para el análisis posterior. Para informar las respuestas de fluorescencia promedio entre las neuronas dentro de una sesión, se calculó ΔF normalizado como (ΔF - ΔFbaseline)/ (ΔFmax - ΔFmin). ΔFbaseline fueron las respuestas medias de -6 a -4 s de un ensayo.

El ancho medio de la respuesta de Ca2+ y la duración del episodio se estimaron primero a partir del ajuste de curva lineal en MATLAB. El coeficiente de correlación entre el ancho medio de la respuesta y la duración del combate se calculó con la función 'corrcoef' de MATLAB.

Para comparar las respuestas a diferentes alimentos dentro de una sesión, se promedió el ΔF para cada neurona en múltiples ensayos. Luego se calculó la puntuación z a partir de esta respuesta promedio.

Para clasificar las respuestas de Ca2+ como "excitadas" o "inhibidas" durante el consumo, primero se calculó el valor inicial a partir de la señal fluorescente promedio del ROI de -6 a -4 segundos de cada prueba. La respuesta máxima se calculó a partir de la señal fluorescente promedio ±1 s alrededor del pico de cada prueba. Se realizó una comparación estadística (prueba de rangos con signo de Wilcoxon) entre los valores iniciales y las respuestas máximas para todos los ensayos. La célula se clasificó como respuesta excitadora si p <0,05 y tenía una respuesta máxima positiva. La célula se clasificó como respuesta inhibidora si p <0,05 y tenía una respuesta máxima negativa. La celda se clasificó como sin respuesta si p > 0,05.

Los procedimientos para preparar cortes cerebrales agudos y realizar registros de células completas con estimulación optogenética fueron similares a los descritos anteriormente (Zhu et al., 2016). Se prepararon cortes coronales de 250 a 300 μm que contenían LS o TU usando un vibratomo (VT-1000S, Leica) en una solución a base de colina helada que contenía (en mM) 110 cloruro de colina, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 1,3 NaH2PO4, 1,3 Na-ascorbato, 0,6 Na-piruvato, 25 glucosa y 25 NaHCO3, saturados con 95% O2 y 5% CO2. Las rebanadas se incubaron en líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado a 32 °C (en mM: 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1,3 MgCl2, 1,3 NaH2PO4, 1,3 Na-ascorbato, 0,6 Na-piruvato, 25 glucosa y 25 NaHCO3) durante al menos 1 h antes de grabar. Las rebanadas se transfirieron a una cámara de grabación y se superfundieron con 2 ml min-1 de líquido cefalorraquídeo artificial. Se llenaron pipetas de parche (2–5 MΩ) extraídas de vidrio de borosilicato (PG10150-4, World Precision Instruments) con una solución interna baja en Cl a base de Cs que contenía (en mM) 135 CsMeSO3, 10 HEPES, 1 EGTA, 3,3 QX-. 314, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP, 8 Na2-fosfocreatina, 290 mOsm kg-1, ajustado a pH 7,3 con CsOH. El registro de pinza de voltaje de celda completa se realizó a temperatura ambiente con un amplificador Multiclamp 700B y un Digidata 1440 A (Molecular Devices). Los datos se tomaron muestras a 10 kHz y se analizaron con Clampfit (Molecular Devices) o MATLAB (MathWorks). Para realizar la fotoestimulación se utilizó un diodo emisor de luz azul (470 nm, Thorlabs) controlado por comandos digitales del Digidata 1440 A. Para registrar las IPSC provocadas por luz, se entregó un pulso de luz azul (473 nm, 1 ms, 0,5 ~ 2 mW) a través de una fibra óptica para iluminar todo el campo de visión. Las IPSC se registraron con un potencial de retención de 0 mV en presencia de CNQX (10 μM). Para bloquear las IPSC, se añadió picrotoxina a la cámara de grabación a través del sistema de perfusión y se incubó durante al menos 5 minutos.

Para el experimento de inmunotinción con c-fos, los ratones se sacrificaron 90 minutos después del inicio de la alimentación. Para el experimento de hibridación in situ de c-fos RNAScope, los ratones se sacrificaron 30 minutos después del inicio de la alimentación. Para la verificación del experimento de activación quimiogenética, se administró CNO (2 mg/kg de peso corporal en solución salina, IP) 0,5 h antes de sacrificar al animal. Los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico y perfundidos transcardialmente con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) seguido de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS. Los cerebros se fijaron posteriormente durante 16 a 24 horas en PFA al 4% en PBS y se deshidrataron durante 24 a 48 horas en sacarosa al 30% hasta que se hundieron hasta el fondo. El tejido se incrustó en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura) en hielo seco antes de seccionarlo. Los cerebros se cortaron en secciones de 40 μm con un criostato (Leica). Se recogieron criosecciones flotantes en PBS. Las secciones de cerebro se lavaron primero en PBS (3 x 10 min), luego se bloquearon a temperatura ambiente con suero de cabra normal (GS) al 10%/Triton X-100 al 0,3% (PBST) y luego se incubaron con anticuerpo primario (Rabbit Anti-c- fos, señalización celular) durante la noche a 4 ° C. Las secciones de cerebro se lavaron en PBST (3 × 10 min), seguidas de una incubación durante 2 h con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (1:1000 en GS PBST al 5%, Invitrogen) y finalmente se contratiñeron con DAPI (1:3000).

Para la hibridación de ARN in situ, se cortó el cerebro del ratón en secciones de 18 μm con un criostato (Leica) y se montó en portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus. Las sondas dirigidas a c-fos (Advanced Cell Diagnostics, n.° 316921-C3), Nts (Advanced Cell Diagnostics, n.° 420441), Penk (Advanced Cell Diagnostics, n.° 318761), Crhr2 (Advanced Cell Diagnostics, n.° 413201), vGAT (Advanced Cell Diagnostics, n.° 413201), Cell Diagnostics, n.° 319191-C3) y vGluT2 (Advanced Cell Diagnostics, n.° 319171-C3) fueron diseñados y validados por Advanced Cell Diagnostics. Se utilizó el ensayo RNAscope v2 (Advanced Cell Diagnostics, n.° 323100) para todos los experimentos FISH de acuerdo con el protocolo del fabricante (ref: Wang et al., 2002). Brevemente, las secciones de cerebro se secaron a 39 °C durante 2 horas, se enjuagaron en 1x PBS, se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% en metona, tampón TR durante 15 minutos, se trataron con proteasa III RNAScope durante 15 minutos a 40 °C. Las secciones de cerebro se incubaron con sondas de ARNm durante 2 horas a 40 °C. Luego, las señales específicas se amplificaron con un tampón de implicación multiplexado y se detectaron con el kit TSA Plus Flucerence (Advanced Cell Diagnostics, n.º 322809).

Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de portaobjetos virtual Olympus (VS120-S6-W) y las analizó un individuo ciego a la identidad de los grupos experimentales. El recuento de células se realizó con el software MATLAB personalizado, como se describe a continuación.

Para contar el número de células c-fos+, Nts+, Penk+, Crhr2+ y CTB+, recolectamos secciones coronales de 40 μm de regiones cerebrales objetivo para cada ratón. Las imágenes se adquirieron con un escáner de portaobjetos (Olympus Virtual Slide Microscope, VS120-S6-W) y luego se realizó el recuento celular con el software MATLAB personalizado.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software V8) o Matlab (2017a, Mathworks). No se utilizaron estadísticas para predeterminar el tamaño de la muestra.

Empleamos un protocolo de alimentación de alimentos sabrosos de acceso limitado, que indujo un consumo robusto de alimentos sabrosos sin ayuno. Este protocolo de alimentación consistió en el acceso diario intermitente a alimentos ricos en sacarosa durante 2 horas, mientras que siempre se proporcionó comida estándar de laboratorio [15, 17]. Los ratones desarrollaron una ingesta estable de alimentos en este período de 2 h, mientras que los ratones de control con acceso ad libitum a la comida estándar comieron poco durante este período (Fig. 1A y Fig. S1A, B). La ingesta de alimentos se restringió principalmente a alimentos sabrosos (Fig. S1C), lo que sugiere que la alimentación fue impulsada principalmente por la palatabilidad de los alimentos, un sello distintivo de la alimentación hedónica.

A El LS se activó durante la ingesta de alimentos ricos en sacarosa sin déficit energético. Panel izquierdo: ingesta de alimentos medida en 2 h para ratones de control (acceso ad libitum a comida estándar, n = 10) y ratones con alimentación hedónica (acceso intermitente a alimentos ricos en sacarosa junto con acceso ad libitum a comida estándar, n = 10). Prueba U de Mann-Whitney. ****P < 0,0001. Panel central: Número de neuronas c-fos+ en el LS de control (n = 10) y ratones de alimentación hedónica (n = 10). Prueba U de Mann-Whitney. ****P < 0,0001. Panel derecho: imágenes representativas de inmunotinción con c-fos en el LS de ratones de control y de alimentación hedónica. Barra de escala: 100 μm. B El LS mostró una activación preferencial cuando los ratones consumieron alimentos ricos en sacarosa (HSF) en comparación con la comida estándar después del ayuno. Panel izquierdo: ingesta de alimentos medida en 2 h para comida estándar (n = 8) o comida rica en sacarosa (n = 8) después de un ayuno nocturno. Prueba U de Mann-Whitney. ****P < 0,0001. Panel central: Número de neuronas c-fos+ en el LS de los grupos en ayunas, en ayunas + comida y en ayunas + HSF. ANOVA unidireccional (F(2, 21) = 6,558, P <0,01) seguido de la prueba post hoc de Tukey. ns, sin diferencia significativa, *P < 0,05 y **P < 0,01. Panel derecho: imágenes representativas de la inmunotinción de c-fos en el LS de los grupos en ayunas, en ayunas + comida y en ayunas + HSF. Barra de escala: 100 μm. C Imágenes representativas de experimentos de hibridación doble in situ para c-fos (verde) y Nts (rojo). Barra de escala: 100 μm. D Imágenes representativas de experimentos dobles de hibridación in situ para c-fos (verde) y Penk (rojo). Barra de escala: 100 μm. E Imágenes representativas de experimentos de hibridación doble in situ para c-fos (verde) y Crhr2 (rojo). Barra de escala: 100 μm. F Porcentajes de células Penk+, Crhr2+ y Nts+ entre la población c-fos+: Penk+/c-fos+ = 19,7 ± 2,5%, Crhr2+/c-fos+ = 13,5 ± 1,3% y Nts+/c-fos+ = 57,6 ± 2,5%. ANOVA unidireccional (F(2,14) = 43,71, P <0,01) seguido de la prueba post hoc de Tukey. ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. Medias ± sem G Imágenes representativas de experimentos de hibridación doble in situ para Nts (rojo) y vGAT (verde). Barra de escala: 100 μm. H Porcentaje de células Nts+ en la población vGAT+ y porcentaje de células vGAT+ en la población Nts+: (Nts+ y vGAT+)/vGAT+ = 21,3 ± 3,8%, (Nts+ y vGAT+)/Nts+ = 100%, y (Nts+ y vGluT2+)/ Nts+ = 1,38 ± 0,5%.

Realizamos inmunotinción para c-fos, un marcador de actividad neuronal reciente, para examinar las neuronas activadas por alimentación hedónica en todo el cerebro. La alimentación hedónica activó múltiples regiones del cerebro, incluido el núcleo paraventricular del tálamo (PVT), LS, corteza cingulada (Cg), SUM, ínsula, hipocampo (Hipp), gris periacueductal (PAG), área tegmental ventral (VTA), núcleo geniculado lateral ventral (VLGMC), TU y zona incerta (ZI) (Fig. S1D y Fig. 1A). Los núcleos hipotalámicos, incluido el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) y el área hipotalámica lateral (LHA), mostraron una mayor expresión de c-fos, lo que coincide con su función en la regulación de la alimentación (Fig. S1D). Entre ellos, PVT y LS mostraron la expresión de c-fos más alta (Fig. S1D).

Las neuronas implicadas en la alimentación hedónica deberían estar más activas cuando los animales consumen alimentos sabrosos. Luego comparamos los niveles de expresión de c-fos en PVT y LS de ratones que consumían alimentos sabrosos versus comida normal después de un ayuno nocturno. El PVT mostró niveles similares de expresión de c-fos cuando los ratones consumieron alimentos ricos en sacarosa y comida regular, mientras que el LS mostró una activación preferencial después de que los ratones consumieron alimentos sabrosos (Fig. 1B y Fig. S1E, F). Por tanto, el LS podría desempeñar un papel único en la regulación de la alimentación hedónica.

El LS contiene varias poblaciones neuronales definidas por distintos marcadores moleculares. Para determinar la identidad molecular de las neuronas LS que fueron activadas por alimentación hedónica, realizamos una hibridación in situ de doble fluorescencia (dFISH) con RNAScope para los ARNm que codifican c-fos y los marcadores neuronales LS neurotensina (Nts), proencefalina (Penk) y corticotropina. factor liberador (Crhr2). RNAScope reveló que el 57,6% ± 2,5% de las neuronas LS activadas por alimentación hedónica eran Nts positivas, mientras que solo el 19,7% ± 2,5% eran Penk positivas y el 13,5% ± 1,3% eran Crhr2 positivas (Fig. 1C-F). Las células c-fos+ activadas por alimentación hedónica se distribuyeron desde el LS rostral al caudal, que es similar al patrón de expresión de Nts (Fig. S1G, H). También realizamos dFISH con sondas para neurotensina y el transportador vesicular GABA (vGAT), un marcador de neuronas GABAérgicas, o el transportador vesicular de glutamato 2 (vGluT2), un marcador de neuronas glutamatérgicas en el área septal. Aproximadamente todas las neuronas positivas para Nts también fueron positivas para vGAT, mientras que las neuronas positivas para Nts constituyeron aproximadamente el 21% de las neuronas GABAérgicas en el LS (Fig. 1G, H).

Empleamos una estrategia de expresión mediada por virus adenoasociados (AAV) dependiente de Cre para manipular específicamente la actividad de las neuronas LSNts y estudiar la función de las neuronas LSNts en la alimentación hedónica. Al inyectar AAV que transportan EGFP de doble flujo (AAV-DIO-EGFP) en el LS de ratones Nts-ires-Cre [18], confirmamos que la expresión estaba restringida a neuronas positivas para Nts en el LS (Fig. S2A, B ). Luego empleamos la neurotoxina tetánica (TeNT), una proteasa que bloquea la liberación de neurotransmisores mediante la escisión de la sinaptobrevina-2, que se usa ampliamente como herramienta molecular para el silenciamiento sináptico [19]. Para verificar la eficiencia del silenciamiento sináptico inducido por TeNT, inyectamos AAV dependientes de Cre que expresan canalrodopsina-2 (ChR2) junto con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) como control o neurotoxina tetánica (TeNT) para el silenciamiento sináptico en el LS de Ratones Nts-ires-Cre (Fig. 2B). En cortes de LS preparados a partir de ratones de control que expresan EGFP, la estimulación luminosa de las neuronas LSNts que expresan ChR2 evocó corrientes postsinápticas inhibidoras sensibles a la picrotoxina (IPSC) robustas en todas las neuronas vecinas de LS negativas para ChR2 (7/7) (Fig. 2C, D) . La expresión de TeNT bloqueó casi por completo la transmisión sináptica de las neuronas LSNts (Fig. 2C, D). Sorprendentemente, el silenciamiento de las salidas sinápticas de las neuronas LSNts promovió fuertemente el consumo de alimentos sabrosos con alto contenido de sacarosa y grasas, pero no de comida estándar en condiciones ad libitum (Fig. 2E, panel superior). Este efecto orexigénico se observó en los períodos de alimentación de 2 y 24 h (Fig. 2E y Fig. S3A-C). Sin embargo, en ratones en ayunas, cuando las necesidades homeostáticas se convirtieron en el principal impulsor de la alimentación, la expresión de TeNT no tuvo ningún efecto en la ingesta de alimentos, independientemente del tipo de alimento (Fig. 2E, panel inferior). También examinamos el efecto de la expresión de TeNT en la ingesta de alimentos líquidos durante la entrega gratuita de un volumen pequeño y fijo (10 μl) de una solución de sacarosa apetecible o Garantizar utilizando un pico para lamer motorizado que estaba equipado con un lickómetro (Fig. S1I– K). La expresión de TeNT también promovió significativamente la ingesta de alimentos líquidos sabrosos, tanto solución de sacarosa como Garantiza, pero no agua (Fig. 2F). También empleamos un enfoque optogenético, que tenía una precisión temporal superior, para silenciar las neuronas LSNts. De acuerdo con el silenciamiento sináptico mediado por TeNT, el silenciamiento optogenético de las neuronas LSNts aumentó sustancialmente la ingesta de Garantizar palatable, lo que ocurrió inmediatamente después del encendido de la luz (Fig. S3G-K). En conjunto, estos resultados revelan un papel importante de las neuronas LSNts en la regulación de la alimentación hedónica.

Un panel izquierdo: esquema que muestra la inyección de AAV-DIO-TeNT en el LS para el silenciamiento sináptico de las neuronas LSNts. Panel derecho: imagen representativa del sitio de inyección y expresión viral en el LS de ratones Nts-ires-Cre. Barra de escala: 500 μm. B Imagen representativa que muestra la expresión de ChR2 (rojo) y TeNT (verde) en neuronas LSNts. Barra de escala: 500 μm (panel superior), 20 μm (panel inferior). C Esquema que muestra el experimento utilizado para registrar corrientes postsinápticas en cortes de LS inducidas por estimulación optogenética de neuronas LSNts. En el corte en el que ChR2 se coexpresó con EYFP, la estimulación con luz azul evocó IPSC robustas (traza gris), que fueron bloqueadas por la picrotoxina (traza roja). En el corte en el que ChR2 se coexpresó con TeNT, la estimulación con luz azul no logró evocar IPSC (trazo verde). D Estadísticas de las amplitudes de las IPSC provocadas por luz en ratones que expresan TeNT (n = 6 células) y EYFP (n = 7 células). ANOVA de dos factores (F(1,11) = 53,46, P <0,0001) seguido de la prueba post hoc de Sidak. ***P < 0,0001. Medias ± sem E Cuantificación de la ingesta de alimentos sólidos durante 2 h en ratones que expresan EYFP (barra gris, n = 6) y TeNT (barra verde, n = 8). Panel superior: la expresión de TeNT aumentó la ingesta de alimentos ricos en sacarosa y grasas, pero no en la comida estándar en condiciones ad libitum. Panel inferior: la expresión de TeNT no tuvo ningún efecto sobre la ingesta de alimentos en ayunas. Prueba U de Mann-Whitney. ***P < 0,001. Medias ± sem F Cuantificación de la ingesta de alimentos líquidos durante 2 h por ratones que expresan EYFP (barra gris, n = 6) y TeNT (barra verde, n = 8). La expresión de TeNT aumentó la ingesta de alimentos líquidos sabrosos pero no de agua. Comportamiento de lamido representativo (panel izquierdo), lamidos acumulativos (panel central) e ingesta total (panel derecho) de agua (panel superior), solución de sacarosa (panel central) y Guarantee (panel inferior) en EYFP- (gris, n = 6) y ratones que expresan TeNT (verde, n = 8). Prueba U de Mann-Whitney. **P < 0,01 y ****P < 0,0001. Medias ± sem G Cuantificación de los cambios en los pesos corporales de ratones que expresan EYFP (barra gris, n = 7) y TeNT (barra verde, n = 7). Panel izquierdo: imágenes representativas que muestran ratones que expresan EYFP y TeNT después de 6 semanas de alimentación con una dieta rica en grasas. Panel derecho: la expresión de TeNT promovió un aumento de peso corporal en ratones alimentados con una dieta alta en grasas, pero no con la comida estándar. Prueba U de Mann-Whitney. ns, sin diferencia significativa, *P < 0,01 y ***P < 0,001. Media ± sem

El fuerte efecto del silenciamiento de los LSNts sobre la ingesta de alimentos sabrosos sugiere que el equilibrio energético podría verse alterado; Luego examinamos la actividad locomotora y el gasto de energía. La inhibición neuronal mediada por optogenética o el silenciamiento sináptico de LSNts mediado por TeNT no tuvo ningún efecto sobre la actividad locomotora general de los ratones en la prueba de campo abierto (Figs. S2G y 3D). La expresión de TeNT no cambió el gasto de energía de los ratones en jaulas metabólicas (Fig. S3E, F). De acuerdo con estos resultados, la expresión de TeNT aumentó significativamente el peso corporal de los ratones que fueron alimentados con una dieta rica en grasas durante 3 semanas (Fig. 2G). Sin embargo, este aumento en el peso corporal no se observó en ratones alimentados con comida regular (Fig. 2G). Estos resultados confirman el papel fundamental de las neuronas LSNts en la regulación de la alimentación hedónica y el peso corporal.

A continuación, examinamos los efectos de la activación de las neuronas LSNts en la ingesta de alimentos. Inyectamos AAV dependientes de Cre que expresan los receptores excitadores de diseño activados exclusivamente por los fármacos de diseño (DREADD) hM3D [20] o mCherry en el LS de ratones Nts-ires-Cre (Fig. 3A). Tres semanas después, una inyección intraperitoneal (IP) de N-óxido de clozapina (CNO, 2 mg/kg), pero no de solución salina, dio como resultado una expresión robusta de c-fos en las neuronas LS que expresan hM3D (Fig. 3B). En condiciones ad libitum, la activación quimiogenética de las neuronas LSNts disminuyó considerablemente la ingesta de alimentos, independientemente del tipo de alimento (Fig. 3C, panel superior). Sin embargo, en ayunas, la activación de las neuronas LSNts solo disminuyó la ingesta de alimentos sabrosos ricos en grasas y sacarosa, pero no en la comida estándar (Fig. 3C, panel inferior). La activación de las neuronas LSNts también suprimió la ingesta de alimentos líquidos sabrosos, tanto la solución de sacarosa como Garantiza (Fig. 3D-E). La activación quimiogenética de LSNts no tuvo ningún efecto sobre la actividad locomotora general de los ratones (Fig. S2D). La manipulación de la actividad de las neuronas LSNts no tuvo ningún efecto sobre el comportamiento relacionado con la ansiedad en la prueba de campo abierto (Figs. S2E y 2H) y no tuvo ningún efecto sobre la presión arterial, la temperatura corporal, el nivel de glucosa en sangre o la frecuencia cardíaca (Fig. S4), lo que sugiere un papel específico de las neuronas LSNts en la regulación de la alimentación.

Un panel izquierdo: esquema que muestra la inyección de AAV-DIO-hM3D en el LS para la activación quimiogenética de las neuronas LSNts. Panel derecho: imagen representativa del lugar de inyección y expresión viral en el LS de ratones Nts-ires-Cre. Barra de escala: 500 μm. B Panel izquierdo: imagen representativa que muestra que la inyección de CNO (2 mg/kg) indujo una expresión robusta de c-fos de neuronas LSNts en ratones que expresan hM3D. Barra de escala: 100 μm. Panel derecho: porcentaje de células c-fos+ entre las neuronas LSNts de los grupos “hM3D + solución salina” (n = 4), “EYFP + CNO” (n = 4) y “hM3D + CNO” (n = 4). ANOVA unidireccional (F(2,9) = 684,5, P <0,001) seguido de la prueba post hoc de Dunnett. ****P < 0,0001. C Cuantificación de la ingesta de alimentos sólidos durante 2 h después de la inyección de solución salina (barra gris) y CNO (barra roja) en ratones que expresan mCherry y hM3D. Panel superior: la inyección de CNO redujo la ingesta de alimentos en condiciones ad libitum en ratones que expresan hM3D (n = 6), pero no en ratones que expresan mCherry (n = 5). ANOVA de dos factores (comida estándar, F(1,18) = 8,202, P < 0,05; alimento rico en sacarosa, F(1,18) = 9,941, P < 0,01; alimento rico en grasas, F(1,18) = 19,27, P < 0,001) seguido de la prueba post hoc de Sidak. **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. Panel inferior: la inyección de CNO redujo la ingesta de alimentos ricos en sacarosa y grasas en condiciones de ayuno y alimentación en ratones que expresan hM3D (n = 6), pero no en ratones que expresan mCherry (n = 5). ANOVA de dos factores (comida estándar, F(1,18) = 0,9784, P > 0,05; alimento rico en sacarosa, F(1,18) = 5,234, P < 0,05; alimento rico en grasas, F(1,18) = 6,420, P < 0,05) seguido de la prueba post hoc de Sidak, ***P < 0,001, significa ± sem D La inyección de CNO redujo la ingesta total de solución de sacarosa (panel superior) y Guarantee (panel inferior) mediante la expresión de hM3D (n = 7) pero no ratones que expresan mCherry (n = 5). Solución de sacarosa: ANOVA de dos vías (F(1,20) = 7,96, P <0,05) seguido de la prueba post hoc de Sidak. ***P < 0,001. Asegúrese de: ANOVA bidireccional (F (1,20) = 15,70, P <0,001) seguido de la prueba post hoc de Tukey. ****P < 0,0001. Media ± sem

Nuestros resultados mostraron que el silenciamiento de las neuronas LSNts promovió específicamente la alimentación hedónica, mientras que la activación de las neuronas LSNts suprimió la alimentación general. Nos preguntamos si diferentes señales de las neuronas LSNts podrían regular de manera diferencial la alimentación hedónica específica y general. En el nivel de actividad fisiológica basal, GABA se liberó y actuó sobre las neuronas postsinápticas, ya que registramos IPSC sensibles a picrotoxina en neuronas postsinápticas locales después de una breve estimulación optogenética (1 ms) de LSNts (Fig. 2C). Tras una fuerte activación quimiogenética, el péptido neurotensina se detectó en regiones posteriores después de una inyección de CNO (Patterson CM et al., 2015). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la liberación de GABA en el nivel de actividad basal suprime la alimentación hedónica, mientras que la neurotensina se reclutó aún más tras una fuerte activación de LSNts para suprimir la alimentación general.

Para examinar esta hipótesis, utilizamos la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 [21] para anular la liberación de GABA o neurotensina en las neuronas LSNts. Diseñamos un ARN guía único (ARNsg) dirigido al transportador vesicular de GABA (vGAT), que es responsable de empaquetar el GABA en vesículas sinápticas y es indispensable para la transmisión sináptica GABAérgica [22], para reducir la liberación de GABA. Después de cruzar ratones Nts-ires-Cre con ratones knock-in Cas9 inducibles por Cre [21], inyectamos un AAV que llevaba tanto vGAT-target (sgRNA) como hM3D-mCherry inducible por Cre en el LS para expresar hM3D en vGAT-knockdown. células (Fig. 4A). Para verificar la eficiencia de la eliminación de vGAT, también inyectamos AAV-DIO-ChR2 en el LS de los animales con eliminación de vGAT y registramos IPSC de neuronas postsinápticas. Una breve estimulación con luz azul (1 ms) evocó IPSC robustas en todas las neuronas registradas (8/8) de animales de sgRNA LacZ de control (Fig. 4B-D, línea gris). Sin embargo, la misma estimulación luminosa no logró evocar ninguna IPSC en todas las neuronas registradas (0/8) de los animales con vGAT desactivado (Fig. 4C, D, línea roja). Estos resultados demostraron la alta eficiencia de nuestra estrategia CRISPR/Cas9 para interrumpir la señalización de GABA.

Un esquema que muestra el diseño experimental para la eliminación de vGAT y Nts mediada por CRISPR/Cas9. El AAV que codifica el sgRNA dirigido a vGAT, el dirigido a Nts o el sgRNA dirigido a LacZ de control y el hM3D inducible por Cre se inyectó en ratones Nts-ires-Cre cruzados con ratones knock-in Cas9 inducibles por Cre. B Esquema que muestra el diseño experimental para la verificación de la caída de vGAT. En ratones de control LacZ o desactivación de vGAT, ChR2 se expresó en neuronas LSNts y se realizaron grabaciones de pinzamiento de parche de células completas en neuronas vecinas Nts negativas. C Rastros representativos de IPSC evocadas por luz para ratones de control LacZ (gris) y vGAT (rojo) con diferentes potencias de luz (de izquierda a derecha: 0,5 mW, 1,0 mW, 1,5 mW, 2,0 mW). D Estadísticas para las amplitudes de las IPSC evocadas por luz en los ratones de control LacZ (gris, n = 8 células) y vGAT knockdown (rojo, n = 8 células). ANOVA de dos factores (F(1,14) = 50,87, P <0,0001) seguido de la prueba post hoc de Sidak. **P < 0,01 y ***P < 0,0001, medias ± sem E Ingesta de alimentos inicial (panel izquierdo: comida estándar, panel derecho: alimentos ricos en sacarosa) mediante control LacZ (amarillo, n = 11), eliminación de vGAT (rojo , n = 9) y ratones Nts knockdown (azul, n = 13). ANOVA unidireccional (comida estándar, F(2,230) = 1,716, P > 0,05; comida sabrosa, F(2,30) = 6,563, P < 0,01) seguido de la prueba post hoc de Tukey. ns, sin diferencia significativa y *P < 0,05. Medias ± sem F Efectos de la activación quimiogenética de las neuronas LSNts en la ingesta de alimentos (panel izquierdo: comida estándar, panel derecho: comida sabrosa) mediante control LacZ (n = 11), eliminación de vGAT (n = 9) y eliminación de Nts (n = 13 ) ratones. ANOVA de dos factores (comida estándar, F(2,60) = 4,661, P <0,05; comida sabrosa, F(2,60) = 5,583, P <0,01) seguido de la prueba post hoc de Sidak. ns, sin diferencia significativa, *P < 0,05, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001, medias ± sem G Imágenes representativas que muestran que la inyección de CNO (2 mg/kg) indujo una expresión robusta de c-fos en neuronas LSNts en ratones control LacZ, eliminación de vGAT y eliminación de Nts. Barra de escala: 100 μm. H Análisis estadístico de la proporción de células c-fos+ después de la inyección de solución salina y CNO en ratones control LacZ (n = 3), eliminación de vGAT (n = 3) y eliminación de Nts (n = 3). ANOVA unidireccional (F(5,12) = 854,6, P <0,0001) seguido de la prueba post hoc de Tukey. ****P < 0,0001. Media ± sem

La caída de vGAT en las neuronas LSNts no tuvo ningún efecto sobre la ingesta de comida estándar, pero aumentó significativamente la ingesta de alimentos sabrosos con alto contenido de sacarosa (Fig. 4E), lo que sugiere que GABA suprime específicamente la alimentación hedónica en condiciones basales. Utilizando un enfoque similar, diseñamos un sgRNA dirigido a Nts para eliminar el péptido de neurotensina. La caída de la neurotensina no tuvo ningún efecto sobre la ingesta de alimentos, independientemente del tipo de alimento (Fig. 4E). Estos resultados sugieren que, en condiciones fisiológicas basales, la señalización de GABA, pero no de la neurotensina, media el efecto supresor de las neuronas LSNts sobre la alimentación hedónica.

A continuación, examinamos el efecto de vGAT o eliminación de neurotensina sobre la activación quimiogenética de las neuronas LSNts. La activación quimiogenética de LSNts mediante una inyección de CNO indujo una expresión robusta de c-fos en los tres grupos de ratones (Fig. 4G, H). En ratones de control LacZ, la activación quimiogenética de las neuronas LSNts suprimió la ingesta de alimentos, independientemente del tipo de alimento (Fig. 4F), de acuerdo con nuestro resultado anterior. En ratones con vGAT desactivado, la administración de CNO también suprimió significativamente la ingesta de alimentos (Fig. 4F), lo que sugiere que la transmisión GABAérgica no es necesaria cuando las neuronas LSNts estaban fuertemente activadas. En ratones Nts knockdown, la inyección de CNO aún suprimió la ingesta de alimentos sabrosos pero no logró suprimir la ingesta de comida, lo que indica además un papel específico de la señalización de GABA en la supresión de la alimentación hedónica. (Figura 4F).

En conjunto, estos experimentos de eliminación de CRISPR/Cas9 indican que tanto la señalización de GABA como de neurotensina de las neuronas LSNts regulan la alimentación, pero actúan en diferentes niveles de actividad. El GABA liberado por las neuronas LSNts proporciona una inhibición tónica para suprimir la alimentación hedónica a nivel basal, mientras que la neurotensina se recluta aún más tras una fuerte activación para suprimir la alimentación general.

Empleamos fotometría de fibra [23] para evaluar la dinámica de la actividad neuronal de LSNts en el comportamiento alimentario y la participación de estas neuronas en la alimentación hedónica. Transdujimos neuronas LSNts con un AAV dependiente de Cre que expresa un indicador de Ca2+ codificado genéticamente (GCaMP6s) [24] e implantamos fibras ópticas en el LS de ratones Nts-ires-Cre. Utilizando fotometría de fibra, registramos señales poblacionales de Ca2+ de las neuronas LSNts durante la búsqueda y el consumo de alimentos. Primero examinamos la actividad de las neuronas LSNts durante la administración condicionada por señales de un volumen pequeño y fijo de Garantizar palatable (Fig. S5A). Las neuronas LSNts mostraron una dinámica robusta de Ca2+ durante la alimentación (Fig. S5B). Sin embargo, la actividad no fue modulada por señales auditivas predictivas de alimentos o por la entrega de alimentos cuando la señal de Ca2+ se alineó con el inicio de la señal (Fig. S5C). Por el contrario, cuando la señal de Ca2+ se alineó con la primera lamida después de la señal, observamos un aumento en la actividad de los LSNts antes de la primera lamida cuando el animal se acercó al pico de comida. Este aumento de actividad fue seguido por una disminución más marcada de la actividad cuando los animales comenzaron a consumir el alimento (Fig. S5D).

También registramos señales de Ca2+ durante un protocolo de alimentación de libre acceso y a su propio ritmo [25] en el que las señales auditivas estaban ausentes y las boquillas de comida siempre estaban disponibles. De acuerdo con la alimentación condicionada por señales, observamos una dinámica bifásica de Ca2+ neuronal de LSNts que exhibió una respuesta excitadora durante la fase de aproximación a los alimentos y una respuesta inhibidora durante la fase de consumo de alimentos (Fig. 5A, panel izquierdo). La respuesta excitatoria durante la fase de aproximación se observó solo cuando el animal fue alimentado con Garantizado palatable pero no con alimento normal o Garantizado diluido (Fig. S6A-C), lo que sugiere que esta actividad no fue causada por correr u otros artefactos motores. Sin embargo, la respuesta inhibidora observada durante la fase de consumo fue similar en diferentes tipos de alimentos (Figs. S6A-C y 6E, F). Tanto las respuestas excitadoras como las inhibidoras disminuyeron cuando la comida se reemplazó con agua (Fig. S6D).

A Panel izquierdo: actividad de Ca2+ de la población de neuronas LSNts durante la alimentación libre de Garantizar. Panel central: actividad de Ca2+ de la población de neuronas LSNts cuando se omitió la comida. Panel derecho: Actividad de Ca2+ de la población de neuronas LSNts cuando se le arregló la cabeza al animal y se le alimentó con Guarantee. Línea vertical discontinua: primera lamida. B Área bajo la curva de actividad de Ca2+ durante la fase de aproximación a la comida (n = 8). ANOVA unidireccional (F(2, 21) = 5,49, P <0,01) seguido de la prueba post hoc de Tukey. *P<0,05. Media ± sem C Área bajo la curva de actividad de Ca2+ durante la fase de consumo de alimentos (n = 8). ANOVA unidireccional (F(2, 21) = 11,05, P <0,01) seguido de la prueba post hoc de Tukey. **P < 0,01 y ***P < 0,001. Media ± sem D Panel superior: esquema que muestra la inyección de AAV-DIO-ChR2 o AAV-DIO-eNpHR en el LS para la manipulación optogenética de las neuronas LSNts. Panel central: imagen representativa que muestra la expresión de ChR2-mCherry en neuronas LSNts. Panel inferior: imagen representativa que muestra la expresión de eNpHR-EYFP. E El efecto de la activación optogenética (azul, n = 4) o la inhibición (amarillo, n = 6) de las neuronas LSNts durante la fase de aproximación a los alimentos en la búsqueda y el consumo de alimentos. Prueba de rangos con signo de Wilcoxon. *P<0,05. F El efecto de la activación optogenética (azul, n = 4) o la inhibición (amarillo, n = 6) de las neuronas LSNts durante la fase de consumo de alimentos en la búsqueda y el consumo de alimentos. Prueba de rangos con signo de Wilcoxon. *P < 0,05 y **P < 0,01.

Con base en estas observaciones, planteamos la hipótesis de que las respuestas excitadoras de las neuronas LSNts durante la fase de aproximación podrían representar la motivación para obtener alimentos sabrosos y, por lo tanto, fueron importantes para impulsar la búsqueda de alimentos y las conductas de aproximación, mientras que las respuestas inhibidoras durante la fase de consumo podrían ser críticas para comportamiento consumatorio general. Omitimos la entrega de alimentos en algunos ensayos para probar esta hipótesis y descubrimos que las respuestas inhibidoras después de la primera lamida desaparecieron, mientras que las respuestas excitadoras durante la fase de aproximación se conservaron (Fig. 5A, panel central). También examinamos la actividad de los LSNts en un procedimiento de alimentación con cabeza fija y cuerpo restringido en el que se eliminó la oportunidad de buscar alimento; Descubrimos que las respuestas excitadoras antes de la primera lamida desaparecieron, pero las respuestas inhibidoras durante el consumo se conservaron (Fig. 5A, panel derecho).

Las respuestas bifásicas predicen que la activación de las neuronas LSNts durante la fase de aproximación facilitaría la búsqueda de alimentos, mientras que la inhibición de las neuronas LSNts durante la fase de consumo es necesaria para el consumo de alimentos. Nuestra anterior inactivación sináptica y activación quimiogenética de TeNT no distinguió entre la dinámica neuronal bloqueada por el enfoque y la bloqueada por el consumo que medimos in vivo. Aprovechando la resolución de milisegundos proporcionada por el método optogenético, manipulamos específicamente la actividad de las neuronas LSNts durante la fase de aproximación frente a la fase de consumo y examinamos sus efectos en la búsqueda y el consumo de alimentos.

Luego expresamos la opsina excitadora ChR2 [26] en neuronas LSNts para la activación optogenética y examinamos el efecto de la activación optogenética temporalmente precisa durante diferentes fases de alimentación (Fig. 5D). La estimulación luminosa durante la fase de aproximación a la comida acortó significativamente la latencia y aumentó la velocidad hacia la zona de la comida (Fig. 5E), lo que sugiere que la activación de las neuronas LSNts durante la fase de aproximación facilitó el comportamiento de búsqueda de comida. Sin embargo, esta manipulación optogenética no tuvo ningún efecto sobre el consumo de alimentos (Fig. 5E). Por el contrario, la activación optogenética de las neuronas LSNts durante la fase de consumo suprimió profundamente el consumo de alimentos, mientras que no cambió los tiempos de entrada a la zona de alimentos pero disminuyó el tiempo pasado dentro de la zona de alimentos (Fig. 5F). A continuación, expresamos la opsina inhibidora eNpHR [27] en neuronas LSNts para lograr un silenciamiento optogenético temporalmente preciso (Fig. 5D). Consistentemente, la inhibición optogenética de las neuronas LSNts durante la fase de aproximación no tuvo efecto sobre el comportamiento consumatorio, mientras que la inhibición optogenética durante la fase de consumo promovió fuertemente la ingesta total de alimentos (Fig. 5E, F).

Debido a que los registros de fotometría de fibra sumaron la actividad de Ca2+ de múltiples neuronas LSNts, dos escenarios posibles podrían explicar las respuestas bifásicas de las neuronas LSNts durante la alimentación. Primero, se activaron o inhibieron distintas subpoblaciones de neuronas LSNts. En segundo lugar, una única población de neuronas LSNts se activó primero durante la aproximación a los alimentos y luego se inhibió durante el consumo de alimentos. Para distinguir estas dos posibilidades, realizamos imágenes de Ca2+ in vivo de neuronas LSNts individuales en ratones que se movían libremente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza y una lente de índice de gradiente implantada (GRIN) [28] (Fig. 6A, B).

Un esquema que muestra imágenes de Ca2+ de neuronas LSNts individuales con un microscopio en miniatura montado en la cabeza. B Dinámica de Ca2+ de 10 células LSNts representativas durante la alimentación. Barra de escala: puntuación 1 z. C Respuestas de Ca2+ de 290 células LSNts alineadas con la primera lamida durante la alimentación libre de Garantizar. Aproximadamente el 31% de las células se activaron y el 32% de las células se inhibieron. D El tiempo hasta el pico de células activadas (n = 88) fue más corto que el tiempo hasta el mínimo de células inhibidas (n = 86). Prueba U de Mann-Whitney. ***P < 0,001. E La media anchura de respuesta de las células activadas (n = 88) fue más corta que la de las células inhibidas (n = 86). Prueba U de Mann-Whitney. ***P < 0,001. F. Respuestas de Ca2+ de 130 células LSNts alineadas con la primera lamida en condiciones de deficiencia alimentaria. Aproximadamente el 40% de las células se activaron y el 11% de las células se inhibieron. G. Porcentajes de células activadas, inhibidas y que no responden en condiciones de alimentación libre (panel izquierdo) y omisión de alimentos (panel derecho). H Área bajo la curva de actividad de Ca2+ para células activadas (panel izquierdo) e inhibidas (panel derecho) durante la alimentación libre de Guarantee y las pruebas de omisión de alimentos. Prueba U de Mann-Whitney. Ns, no hay diferencia significativa. I. Correlación entre el ancho medio de la respuesta y la duración del episodio para neuronas inhibidas (panel izquierdo) y activadas (panel central). Panel derecho: el coeficiente de correlación entre la respuesta y el comportamiento de las células inhibidas fue mayor que el de las células activadas. Prueba U de Mann-Whitney. ***P < 0,001. J Respuesta de Ca2+ de las células activadas (panel derecho) e inhibidas (panel izquierdo) cuando se alinean con la última lamida durante la alimentación libre de Garantizar. K. Respuesta de Ca2+ de las neuronas LSNts a la solución de sacarosa y Garantizar (n = 143 neuronas de 4 ratones) agrupadas por agrupación de k-medias. Línea discontinua vertical: primera lamida. Respuesta de L Ca2+ de las neuronas LSNts a la comida Garantizada y regular (n = 124 neuronas de 4 ratones) agrupadas por agrupación de k-medias. Línea discontinua vertical: primera lamida. Respuesta M Ca2+ de las neuronas LSNts a Garantizar y agua (n = 161 neuronas de 4 ratones) agrupadas por agrupación de k-medias. Línea discontinua vertical: primera lamida. N Porcentajes de células activadas, inhibidas y que no responden identificadas durante la alimentación gratuita con Guarantee, solución de sacarosa, comida regular y agua.

Expresamos GCaMP6 en neuronas LSNts y tomamos imágenes de la actividad de Ca2+ de células individuales a través de un microscopio en miniatura montado en la cabeza durante la alimentación de libre acceso y a su propio ritmo con el palatable Garantizar. Las neuronas LSNts respondieron mejor cuando los animales se acercaron y comenzaron a consumir alimentos (alrededor de la primera lamida); El 31% de las neuronas se activaron significativamente y el 32% se inhibieron significativamente (Fig. 6C, G). Las neuronas activadas tendían a responder más rápido; alcanzaron su pico a 0,3 ± 0,1 s antes de la primera lamida, mientras que las células inhibidas alcanzaron su nadir a 3,6 ± 0,3 s después de la primera lamida (Fig. 6D). Las células activadas también mostraron una ventana de respuesta más estrecha, con un ancho medio significativamente menor (3,7 ± 0,3 s) que las células inhibidas (6,8 ± 0,4 s) (Fig. 6E y Fig. S6G). Estas diferencias en la cinética temporal de las dos poblaciones neuronales podrían contribuir a la respuesta bifásica que observamos en nuestro registro de fotometría de fibra. Para probar esta posibilidad, normalizamos la respuesta de cada célula y las sumamos; Descubrimos que la respuesta sumada de la población exhibió una respuesta bifásica (Fig. S7H), que recuerda a la respuesta de fotometría.

Examinamos el papel preciso de las poblaciones neuronales de LSNts activadas e inhibidas en la alimentación mediante la realización de imágenes durante los ensayos de omisión de alimentos. Cuando se omitió la comida, el porcentaje de neuronas LSNts inhibidas disminuyó al 11% (Fig. 6F, G), mientras que la porción de neuronas activadas permaneció alta (40%), lo que sugiere que las neuronas inhibidas estuvieron involucradas principalmente en la fase consumatoria de la alimentación. comportamientos. La amplitud de respuesta media de las neuronas activadas e inhibidas en condiciones de privación de alimentos fue similar a la de las condiciones de alimentación libre (Fig. 6H). A continuación, examinamos si la respuesta de las neuronas inhibidas podría rastrear el comportamiento consumativo. Analizamos la relación entre la respuesta de Ca2+ y el comportamiento de lamido tísico en cada ensayo y observamos una correlación significativa entre la duración del episodio y la duración de la respuesta de la población neuronal inhibida (Fig. 6I). El coeficiente de correlación calculado entre la duración del combate y el ancho medio de la respuesta fue significativamente mayor para la población inhibida (0,69 ± 0,05) que para la población activada (0,28 ± 0,05) (Fig. 6I), lo que sugiere un papel para la población LSNts inhibida en la consumación. comportamiento. Para examinar más a fondo si las neuronas inhibidas pueden interrumpir el consumo de alimentos, alineamos las respuestas con la última lamida y descubrimos que la respuesta volvió a la línea de base inmediatamente después de la última lamida (Fig. 6J). Por tanto, las neuronas LSNts inhibidas contribuyen principalmente al consumo de alimentos.

A continuación, monitoreamos la actividad de las neuronas LSNts durante la alimentación de alimentos con diferente palatabilidad. Los alimentos analizados incluyeron una solución palatable de Guarantee o sacarosa, agua o comida normal neutra. Entregamos dos alimentos diferentes secuencialmente en la misma sesión y utilizamos agrupaciones de k-medias no supervisadas de respuestas a dos alimentos diferentes para lograr la identificación precisa de las respuestas de las mismas células a diferentes alimentos [25]. Comparamos las respuestas de la alimentación gratuita con Guarantee y solución de sacarosa y observamos respuestas similares. Tanto Guarantee como la sacarosa activaron e inhibieron una proporción similar de neuronas LSNts (Fig. 6K). Las neuronas LSNts que fueron activadas e inhibidas por Garantizar y sacarosa eran en gran medida la misma subpoblación. Sin embargo, la proporción de células activadas fue significativamente menor durante la alimentación con alimentos regulares (11%) o agua (9%) (Fig. 6L-N). Estos resultados indicaron que las neuronas LSNts activadas están más estrechamente correlacionadas con la palatabilidad de los alimentos.

Para explorar más a fondo los mecanismos del circuito de regulación de la alimentación por las neuronas LSNts, mapeamos sistemáticamente las proyecciones de las neuronas LSNts utilizando SynaptoTag AAV, que coexpresa la proteína fluorescente roja tdTomato y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) fusionada a la proteína de la vesícula sináptica sinaptofisina [19] . Inyectamos AAV-FLEX-tdTomato-T2A-sinaptofisina-EGFP en el LS de ratones Nts-ires-cre (Fig. 7A). Las neuronas infectadas con SynaptoTag AAV se llenaron con tdTomato en su citoplasma y fibras axónicas y sinaptofisina fluorescente verde localizada en las sinapsis eferentes. Con esta estrategia de rastreo, encontramos que las neuronas LSNts establecieron conexiones sinápticas importantes con varias regiones del cerebro, incluido el área preóptica lateral y medial (POA), el núcleo tuberal (TU), el núcleo hipotalámico anterior (AHN) y el núcleo supramamilar (SUM). Figuras 7B, C). Expresamos ChR2 en neuronas LSNts y realizamos registros de células completas de neuronas TU en cortes para verificar las conexiones sinápticas funcionales. La breve estimulación con luz azul de las terminales axonales de los LSNts en la TU evocó IPSC robustas sensibles a la picrotoxina de ~ 50% de las neuronas TU registradas (Fig. S7C-E), lo que confirma las conexiones sinápticas GABAérgicas funcionales entre las neuronas LSNts y TU.

Un esquema que muestra la estrategia SynaptoTag AAV para mapear las proyecciones de las neuronas LSNts. B Imagen representativa del lugar de la inyección y la expresión viral en el LS de ratones Nts-ires-Cre. C Imágenes representativas que muestran axones que expresan tdTomato y terminales de axones que expresan GFP en diferentes regiones. Barra de escala: 200 μm. D Esquema que muestra la estrategia viral utilizada para activar las neuronas LSNts que se proyectan a un objetivo posterior específico mediante un enfoque quimiogenético. Cuantificación de la ingesta de alimentos estándar (E), ricos en sacarosa (F) y ricos en grasas (G) después de la activación quimiogenética de cada proyección de LSNts. Grupo control, n = 7; LSNts→grupo POA, n = 6; grupo LSNts→AHN, n = 6; LSNts→grupo TU, n = 7; LSNts→grupo SUM, n = 8. ANOVA bidireccional (comida estándar, F(4,68) = 2,854, P < 0,05; alimento rico en sacarosa, F(4,58) = 9,145, P < 0,0001; alimentos grasos, F(4,58) = 4,541, P < 0,0001) seguido de la prueba post hoc de Sidak. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001. Medias ± sem H Panel superior: esquema que muestra la estrategia viral utilizada para inhibir las neuronas LSNts que se proyectan a TU mediante un enfoque optogenético. Panel inferior: imágenes representativas que muestran la expresión de eNpHR-EYFP en neuronas LSNts que se proyectan hacia la TU. Barra de escala: 200 μm. I La inhibición optogenética de las neuronas LSNts que proyectan TU no tuvo ningún efecto sobre la ingesta regular de alimentos. Grupo control EYFP, n = 5; Grupo eNpHR, n = 6. ANOVA bidireccional (F(1,18) = 0,2096, P > 0,05). Medias ± sem J La inhibición optogenética de las neuronas LSNts que proyectan TU aumentó significativamente la ingesta de Garantizar. Grupo control EYFP, n = 5; Grupo eNpHR, n = 6. ANOVA de dos vías (F(1,18) = 5,341, P <0,05) seguido de la prueba post hoc de Sidak. **P<0,01. Medias ± sem K Imágenes representativas que muestran los resultados de la hibridación in situ para la señal de ARNm del receptor de neurotensina 1 (NtsR1) en SUM. L Esquema que muestra el diseño experimental para la infusión local del péptido Nts en el SUM. M Cuantificación de la ingesta de comida estándar durante 2 h después de la administración de solución salina (barra gris, n = 8) o Nts (barra azul, n = 8) al SUM. Prueba de rangos con signo de Wilcoxon. ***P < 0,001. N Cuantificación de la ingesta de alimentos ricos en grasas durante 2 h después de la administración de solución salina (barra gris, n = 8) o Nts (barra azul, n = 8) al SUM. Prueba de rangos con signo de Wilcoxon. **P<0,01. O Actividad promedio de Ca2+ de LSNts→TU registrada mediante fotometría de fibra durante la alimentación gratuita con alimentos regulares (panel izquierdo) o Garantiza (panel derecho). Panel superior: promedio de población de 5 ratones. Panel inferior: actividad de Ca2+ en ratones individuales. P Actividad promedio de Ca2+ del circuito LSNts→SUM registrada por fotometría de fibra durante la alimentación gratuita de alimentos regulares (panel izquierdo) o Garantiza (panel derecho). Panel superior: promedio de población de 3 ratones. Panel inferior: actividad de Ca2+ en ratones individuales.

Para revelar la organización anatómica de las proyecciones de LSNts, inyectamos los trazadores retrógrados CTB555 y CTB647/488 en la TU y otros objetivos posteriores de LSNts y examinamos la superposición entre las neuronas LSNts marcadas con CTB que se proyectan a objetivos distintos (Fig. S9). Solo el 6,0% de las neuronas LSNts que proyectan TU se proyectaron al POA, el 8,3% de las neuronas LSNts que proyectan TU se proyectaron al AHN y el 11,3% de las neuronas LSNts que proyectan TU se proyectaron al SUM (Fig. S9B-E), lo que sugiere poca superposición entre neuronas LSNts que proyectan TU y POA, AHN y SUM. Como se esperaba, la coinyección de CTB555 y CTB647 en la TU dio como resultado un alto porcentaje de coetiquetado (92,9% para CTB555 y 66,0% para CTB647) (Fig. S9F). Usando un método similar, observamos poca superposición entre cada dos pares de proyecciones descendentes de LSNts (Fig. S9B), lo que respalda un patrón de proyección uno a uno de las neuronas de LSNts.

Examinamos qué proyección de LSNts es crítica en la regulación de la alimentación hedónica inyectando retroAAV-FLEX-FlpO en uno de los objetivos de proyección posteriores y AAV-fDIO-hM3D en el LS de ratones Nts-ires-Cre (Fig. 7D). Esta estrategia dio como resultado la expresión selectiva de hM3D en neuronas LSNts que se proyectan a un objetivo posterior específico, y la cantidad de neuronas LSNts que expresan hM3D fue comparable entre diferentes vías (Fig. S7A, B). La activación de los circuitos LSNts → POA, LSNts → AHN y LSNts → SUM mediante inyección de CNO suprimió significativamente la ingesta de alimentos, independientemente del tipo de alimento (Fig. 7E-G). Sin embargo, la activación de la vía LSNts → TU suprimió específicamente el consumo de alimentos sabrosos ricos en grasas y sacarosa, pero no en el alimento estándar (Fig. 7E-G). La activación de la vía LSNts →TU no tuvo efecto sobre la actividad locomotora general ni sobre el comportamiento similar a la ansiedad en la prueba de campo abierto (Fig. S7H-J). Debido al papel específico de la vía LSNts → TU en la alimentación hedónica, luego probamos si silenciar esta vía mejoraba la alimentación hedónica. Empleamos una estrategia optogenética específica de la vía para inhibir la vía LSNts → TU (Fig. 7H). De hecho, la inhibición de la vía LSNts → TU promovió la alimentación con un alimento palatable Garantizado pero no estándar (Fig. 7I, J). Recientemente se ha informado que las neuronas positivas para somatostatina (SST) en la TU median la alimentación excesiva impulsada por el contexto, principalmente alimentación hedónica [8]. También examinamos la distribución de las terminales axonales de LSNts en la TU y detectamos una amplia superposición entre los botones sinápticos positivos para sinaptofisina de LSNts y las neuronas positivas para SST en la TU (Fig. S7F, G).

Examinamos si las áreas de proyección aguas abajo de las neuronas LSNts expresan receptores de neurotensina y, por lo tanto, median potencialmente el efecto anoréxico de la señalización de neurotensina mediante la realización de una hibridación in situ para detectar el ARNm del receptor de neurotensina 1 (NtsR1) en los 4 objetivos de proyección principales. Observamos una señal robusta de ARNm de NtsR1 en SUM, mientras que se detectó poco o ningún ARNm de NtsR1 en POA, AHN y TU. (Figuras 7K y S8A). La infusión local de péptido de neurotensina (1 μg) en el SUM suprimió la alimentación, independientemente del tipo de alimento, lo que indica que la señal de neurotensina en el SUM es suficiente para suprimir la alimentación general (Fig. 7L-N). Por el contrario, la infusión de neurotensina en la TU no tuvo ningún efecto de alimentación (Fig. S8A-C), lo que coincide con la ausencia de expresión del receptor de neurotensina. Para examinar cómo la neurotensina afecta la actividad neuronal, realizamos un registro de pinzamiento de células completas de neuronas TU y SUM. En la preparación de cortes, la aplicación de neurotensina (2 μM) aumentó el potencial de acción que se activa en 3/6 de las neuronas registradas en SUM (Fig. S8H). Sin embargo, ninguna neurona en TU (0/7) mostró respuesta a la aplicación de neurotensina en el corte (Fig. S8G). También infundimos neurotensina (1 μg) localmente en SUM in vivo y observamos una expresión robusta de c-fos (Fig. S8D-F), lo que confirma aún más que la señal de neurotensina activa las neuronas SUM.

Para examinar la posibilidad de que surjan respuestas excitadoras e inhibidoras de las neuronas LSNts que se proyectan a distintos objetivos posteriores, registramos la dinámica del Ca2+ de las vías LSNts→TU y LSNts→SUM expresando GCaMP en neuronas LSNts que proyectan TU o SUM. De manera similar a la población LSNts, LSNts→TU exhibió respuestas bifásicas durante la alimentación gratuita Garantizada (Fig. 7O). Sin embargo, LSNts→SUM mostró una respuesta inhibidora pura, y la amplitud de la respuesta fue mayor cuando los ratones consumían Garantizar que cuando consumían alimentos normales (Fig. 7P).

La activación de las neuronas LSNts suprimió la alimentación, mientras que la manipulación de las neuronas LSNts no tuvo efecto sobre el gasto de energía. Nos preguntamos si mejorar la actividad neuronal de LSNts prevendría la obesidad inducida por una dieta alta en grasas, y activamos crónicamente las neuronas de LSNts con un enfoque quimiogenético (Fig. 8A). En los ratones de control, el peso corporal aumentó rápidamente tras la introducción de la dieta alta en grasas y aumentó en un 37% ± 4% después de 6 semanas (Fig. 8B, línea roja), mientras que el peso corporal de los ratones mantenidos solo con una dieta estándar aumentó en un 14% ± 1% (Fig. 8B, línea gris). La activación quimiogenética de las neuronas LSNts mediante una inyección IP diaria de CNO revirtió el aumento del peso corporal (10% ± 1%) (Fig. 8B, línea verde). Utilizando una estrategia viral interseccional, transdujimos selectivamente hM3D en neuronas LSNts que proyectan TU inyectando retroAAV-FLEX-FlpO en TU y AAV-fDIO-hM3D en el LS de ratones Nts-ires-Cre. La activación quimiogenética de LSNts→TU también redujo significativamente el aumento de peso corporal inducido por una dieta rica en grasas (21% ± 3%) (Fig. 8B, línea naranja). La activación crónica de la vía LSNts→TU no tuvo efecto sobre la actividad locomotora o el comportamiento relacionado con la ansiedad en una prueba de campo abierto (Fig. 8D, E). Según estos resultados, la activación de las neuronas LSNts o del circuito LSNts→TU es suficiente para reducir la obesidad inducida por una dieta alta en grasas.

Un esquema que muestra el diseño experimental para la activación quimiogenética crónica de las neuronas LSNts en un modelo de obesidad inducida por una dieta rica en grasas. B Cambios en el peso corporal de los ratones de control alimentados con comida estándar (gris, n = 5), los ratones de control alimentados con una dieta alta en grasas (rojo, n = 5), los ratones LSNts::hM3D alimentados con una dieta alta en grasas (verde, n = 7) y ratones LSNts→TU::hM3D alimentados con una dieta alta en grasas (naranja, n = 9) durante varias semanas. ANOVA de dos vías (F(3,22) = 13,74, P <0,0001). Medias ± sem C Cambios en el peso corporal de los ratones de control alimentados con comida estándar (gris, n = 5), los ratones de control alimentados con una dieta alta en grasas (rojo, n = 5), los ratones LSNts::hM3D alimentados con una dieta alta en grasas (verde, n = 7) y ratones LSNts→TU::hM3D alimentados con una dieta alta en grasas (naranja, n = 9) después de 6 semanas. ANOVA de dos factores (F(3,22) = 11,4, P <0,001) seguido de la prueba post hoc de Tukey. *P < 0,05 y ***P < 0,001. Medias ± sem D La actividad locomotora promedio de los ratones de control alimentados con comida estándar (gris, n = 5), los ratones de control alimentados con una dieta alta en grasas (rojo, n = 5), los ratones LSNts::hM3D alimentados con una dieta alta en grasas ( verde, n = 7) y ratones LSNts→TU::hM3D alimentados con una dieta alta en grasas (naranja, n = 9). ANOVA unidireccional (F(3,22) = 0,15, P > 0,05). Medias ± sem E La duración en el centro de la prueba de campo abierto para ratones de control alimentados con comida estándar (gris, n = 5), ratones de control alimentados con una dieta alta en grasas (rojo, n = 5), ratones LSNts::hM3D alimentados una dieta alta en grasas (verde, n = 7) y ratones LSNts→TU::hM3D alimentados con una dieta alta en grasas (naranja, n = 9). ANOVA unidireccional (F(3,22) = 1,19, P > 0,05). Media ± sem F Modelo de trabajo del mecanismo molecular y de circuitos mediante el cual las neuronas LSNts regulan la alimentación hedónica y el peso corporal.

En el presente estudio, identificamos un grupo de neuronas GABAérgicas que expresan neurotensina en el LS que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la alimentación hedónica. El silenciamiento de las neuronas LSNts promovió la alimentación hedónica, que fue mediada por proyecciones GABAérgicas a la TU. La activación de las neuronas LSNts suprimió el consumo general de alimentos, que estuvo mediado por proyecciones a SUM, AHN y POA. La señalización de neurotensina en el SUM es suficiente para suprimir la alimentación general. La identificación de las moléculas, los tipos de células y los circuitos precisos implicados en la regulación de la alimentación hedónica podría ayudar en el desarrollo de mejores fármacos contra la obesidad, dados los efectos secundarios no deseados de los fármacos actuales dirigidos a los circuitos homeostáticos.

El LS ha estado implicado en varios procesos fisiológicos, incluidos el estrés y la ansiedad [16, 29,30,31]. El LS contiene muchos tipos de células molecularmente distintas [32]. Una hipótesis intrigante es que distintos tipos de células contribuyen a diferentes funciones fisiológicas. Se ha demostrado que un subconjunto de neuronas LS que expresan Crhr2 (LSCrhr2) median el comportamiento de ansiedad persistente inducido por el estrés [16]. Nuestros resultados revelan un papel crítico de las neuronas LSNts en la modulación de la alimentación hedónica pero no de la ansiedad, lo que respalda aún más la hipótesis de que distintos subtipos neuronales en el LS median diferentes procesos fisiológicos.

Las neuronas LSNts son un subconjunto de neuronas GABAérgicas en el LS que expresan neurotensina. Nuestros resultados mostraron que las neuronas LSNts liberan GABA para actuar sobre objetivos cerebrales posteriores, ya que una breve activación optogenética de las neuronas LSNts evocaba fuertes corrientes postsinápticas inhibidoras sensibles a las picrotoxinas. La activación quimiogenética de las neuronas que expresan neurotensina provoca la liberación de neurotensina en áreas cerebrales posteriores [33]. Por tanto, las neuronas LSNts liberan tanto el neurotransmisor canónico GABA como el péptido neurotensina. Utilizando la eliminación de genes mediada por CRISPR/Cas9, revelamos funciones distintas para la señalización de GABA y neurotensina en la modulación de la alimentación hedónica. A nivel fisiológico basal, la señalización GABA suprimió específicamente la alimentación hedónica, ya que la caída de vGAT promovió la ingesta de alimentos sabrosos pero no de comida regular. Sin embargo, la activación quimiogenética de los LSNts aún suprimió la ingesta de alimentos sabrosos y de comida en ratones con vGAT desactivado, lo que sugiere la participación de la señalización de la neurotensina en la supresión de la alimentación general. Utilizando una técnica de hibridación in situ, detectamos la expresión del receptor 1 de neurotensina en el SUM (Fig. 7K), que es uno de los objetivos de proyección descendentes de las neuronas LSNts. Además, demostramos que una infusión local de neurotensina en el SUM suprimió la ingesta tanto de alimentos sabrosos como de comida regular, lo que sugiere la participación de la señal de neurotensina en la vía LSNts → SUM en la supresión de la alimentación general.

Un estudio reciente informó que las neuronas neurotensina en LS están relacionadas con la supresión del apetito [31]. Las neuronas LSNts fueron activadas por el estrés y la activación quimiogenética de las LSNts condujo a la supresión general de alimentos, por lo que este estudio sugirió un papel importante para las neuronas LSNts en la contribución a la supresión alimentaria inducida por el estrés [31]. Sin embargo, es poco probable que el efecto anoréxico observado en nuestro experimento se deba a la supresión de alimentos inducida por el estrés por las razones que se describen a continuación. Primero, en nuestro modelo de alimentación hedónica, los ratones se habían habituado a una dieta sabrosa durante al menos 3 días; por tanto, el efecto del estrés probablemente fue mínimo. En segundo lugar, el silenciamiento sináptico de LSNts mediado por TeNT aumentó el peso corporal de los ratones alimentados con una dieta rica en grasas, pero no tuvo ningún efecto sobre el peso corporal de los ratones alimentados con una dieta regular. Esta diferencia no se atribuyó al estrés, ya que ambos animales fueron criados en las mismas condiciones y tenían niveles de estrés similares. En cambio, este resultado indica que las neuronas LSNts limitan la alimentación hedónica en condiciones fisiológicas. En tercer lugar, utilizando imágenes microscópicas de Ca2+ en miniatura in vivo, observamos que el 31% de las neuronas LSNts se activaban mientras que el 32% de las neuronas se inhibían durante la alimentación libre de alimentos sabrosos. Además, también examinamos las respuestas del mismo grupo de neuronas LSNts al estrés (shock en los pies) y descubrimos que la mayoría de las neuronas LSNts (74%) fueron activadas por el estrés (Fig. S6I). Por lo tanto, es muy probable que la fuerte activación de las neuronas LSNts por el estrés promueva la liberación de neurotensina para suprimir la ingesta general de alimentos. Aunque las neuronas LSNts pueden vincular el estrés con la supresión de alimentos, nuestros estudios revelaron un papel importante de las neuronas LSNts en la modulación de la alimentación hedónica en un entorno no estresante. Además, nuestros experimentos microscópicos de imágenes de Ca2+ en miniatura revelaron la heterogeneidad de las neuronas LSNts durante la alimentación, que no se ha caracterizado en la literatura anterior.

Nuestros experimentos de rastreo de circuitos revelaron que las neuronas LSNts se proyectan a múltiples objetivos posteriores, incluidos POA, AHN, TU y SUM. Mientras que la activación de las proyecciones al POA, AHN y SUM suprimieron la alimentación general, la activación del circuito LSNts→TU inhibió específicamente el consumo de alimentos sabrosos. Estos resultados sugieren un papel único para la vía LSNts→TU en la regulación de la alimentación hedónica. Curiosamente, recientemente se ha informado que las neuronas positivas para SST en el núcleo tuberal median la alimentación no homeostática impulsada por el contexto ambiental, principalmente alimentación hedónica [8]. Nuestro rastreo anterógrado mediado por SynaptoTag reveló contactos sólidos entre los botones sinápticos de las neuronas LSNts y las neuronas positivas para SST en la TU. Por lo tanto, una hipótesis plausible es que el efecto del circuito LSNts →TU sobre la supresión de la alimentación hedónica está mediado al menos parcialmente por neuronas SST en la TU.

Nuestro experimento de imágenes con miniscopio reveló dos poblaciones de neuronas LSNts que se activaban e inhibían durante la alimentación. Este hallazgo explica la respuesta bifásica observada en nuestro experimento de fotometría de fibra. La subpoblación de LSNts inhibidos exhibió una latencia de respuesta más lenta y una ventana de respuesta más amplia que la subpoblación de LSNts activados. Las diferencias en la cinética temporal de esas dos poblaciones de LSNts dieron como resultado respuestas bifásicas a nivel de población. Nuestro análisis de la dinámica neuronal y los experimentos de perturbación indican un efecto dominante de la subpoblación de LSNts inhibidos en la ingesta de alimentos. Nuestros resultados también revelan la heterogeneidad de las neuronas LSNts y enfatizan la importancia de monitorear la actividad neuronal individual durante los procesos fisiológicos. En el futuro, un objetivo importante es determinar si estas subpoblaciones de LSNts activadas e inhibidas tienen diferentes perfiles moleculares y si difieren en sus entradas sinápticas y patrones de proyección.

En resumen, nuestros resultados identifican un nuevo circuito LS que desempeña un papel importante en la regulación de la alimentación hedónica y la obesidad. Las proyecciones de las neuronas LSNts a TU suprimen la alimentación hedónica a través de la señalización GABA, mientras que las proyecciones de las neuronas LSNts a POA, AHN y SUM suprimen la alimentación general. La señal de neurotensina en la vía LSNts → SUM es suficiente para suprimir la alimentación general (Fig. 8F). Estos hallazgos amplían nuestra comprensión de los circuitos neuronales que subyacen a la alimentación hedónica más allá del sistema de recompensa dopaminérgico mesolímbico clásico y ayudarán a desarrollar intervenciones para la alimentación excesiva impulsada por la palatabilidad de los alimentos y la obesidad resultante.

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Agradecemos al Dr. Erwin Neher, al Dr. Yu-Tian Wang, al Dr. Xiaoke Chen y al Dr. Lei Yuan por brindar comentarios interesantes sobre el manuscrito. Agradecemos al Dr. Minmin Luo, al Dr. Yang Dan y al Dr. Chenyan Ma por su ayuda con los experimentos CRISPR/Cas9; al Dr. Jian Zhang por ayudar con la medición de la presión arterial; al Dr. Cheng Wang y al Dr. Zhen Zhang por su ayuda con el experimento de imágenes con miniscopio; Dr. Qingfeng Wu y Si Li por su ayuda con el experimento de hibridación in situ; y al Dr. Fan Yang y Dashuang Gao por su ayuda con las mediciones metabólicas. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Innovación en Ciencia y Tecnología 2030 - Proyecto principal (2021ZD0202103), Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81922024, 82171492 y 31900735), Comisión de Ciencia, Tecnología e Innovación del Municipio de Shenzhen (RCJC20200714114556103, JCYJ201805071824201 14 y ZDSYS20190902093601675) , Programa de Investigación Frontier del Laboratorio Bioland (Laboratorio de Salud y Medicina Regenerativa de Guangdong) (2018GZR110105006) y Laboratorio Provincial Clave de Conectoma y Comportamiento Cerebral de Guangdong (2017B030301017). ZL recibió el apoyo de subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2016YFD0400800) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (11079019 y 31070616).

Estos autores contribuyeron igualmente: Zijun Chen, Gaowei Chen.

Laboratorio Clave de Adicción a las Drogas de Shenzhen, Laboratorio de Plasticidad Neural Neher de Shenzhen, Instituto de Cognición Cerebral y Enfermedades Cerebrales, Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen, Academia de Ciencias de China; Instituto de Ciencias del Cerebro de Shenzhen-Hong Kong-Instituciones de Investigación Fundamental de Shenzhen, Shenzhen, 518055, China

Zijun Chen, Gaowei Chen, Jiafeng Zhong, Shishi Lai, Hua Xu, Xiaofei Deng, Fengling Li, Shanshan Lu, Kuikui Zhou y Yingjie Zhu

Universidad de la Academia de Ciencias de China, 100049, Beijing, China

Gaowei Chen, Jiafeng Zhong, Shanshan Lu, Xu Zhang y Yingjie Zhu

Universidad Tecnológica de Henan, Henan, 450001, China

Shaolei Jiang y Zhongdong Liu

Universidad de Shanghai para la Ciencia y la Tecnología, Shanghai, 200093, China

Shaolei Jiang

Facultad de Ciencias de la Vida y la Salud, Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen, Academia China de Ciencias, Shenzhen, 518055, China

Kuikui Zhou y Yingjie Zhu

Instituto de Ciencia y Tecnología de Inteligencia de Guangdong, Distrito de Hengqin, Zhuhai, Guangdong, 519031, China

Changlin Li y Xu Zhang

Unidad de Investigación de Medicina del Dolor, Academia China de Ciencias Médicas; Laboratorio Conjunto SIMR de Innovación Farmacéutica, Instituto de Investigación Avanzada de Shanghai, Academia de Ciencias de China, Shanghai, 201210, China

Xu Zhang

Centro CAS para la Excelencia en Ciencia del Cerebro y Tecnología de Inteligencia, Academia China de Ciencias, Shanghai, 200031, China

Yingjie Zhu

Laboratorio clave CAS de conectoma y manipulación cerebral, Instituto de Cognición Cerebral y Enfermedades Cerebrales (BCBDI), Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen (SIAT), Academia China de Ciencias, Shenzhen, 518055, China

Yingjie Zhu

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YZ concibió el estudio. ZC, GC e YZ diseñaron los experimentos y analizaron los datos. ZC realizó rastreos, pruebas de comportamiento y cortes de fisiología con la ayuda de JZ, SL y SJ. GC realizó hibridación in situ, registro de fotometría de fibra y experimentos de imágenes con miniscopio con la ayuda de SL, HX, FL y XD; YZ escribió el manuscrito con aportaciones de ZC y GC. KZ, CL, ZL y XZ revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Yingjie Zhu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chen, Z., Chen, G., Zhong, J. et al. Un circuito desde las neuronas neurotensinas del tabique lateral hasta el núcleo tuberal controla la alimentación hedónica. Mol Psiquiatría 27, 4843–4860 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01742-0

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Recibido: 22 de marzo de 2022

Revisado: 08 de agosto de 2022

Aceptado: 10 de agosto de 2022

Publicado: 26 de agosto de 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01742-0

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